Die Orgel der Basilika Santa Barbara ist ein Werk des Orgelbauers Graziadio Antegnati aus Brescia von 1565. Der damalige Hoforganist der Conzaga und berühmte Komponist Girolamo Cavazzoni überwachte den Bau der Orgel, an der er bis 1577 selber als Organist wirkte. Das Instrument war mit neun Ripieno-Register, zwei Flöten und Fiffaro disponiert. Ein Zeichen für den hohen Stellenwert der Musikpflege in Santa Barbara mag die Einrichtung von Subsemitonien sein, wodurch ein größeres spielbares Tonartenspektrum geboten war.

Nur fünf Jahre nach Fertigstellung der Orgel musste sie aufgrund der Bauarbeiten in der Kirche überholt werden. Zwei größere Arbeiten erfolgten Ende des 16. Jahrhunderts durch Bernardo Virchi und 1624 durch Tomaso Meiarini. In den ersten Jahrzehnten des 18. Jahrhunderts verlor die Orgel nach ihrer Glanzzeit im 17. Jahrhundert an Qulität, da zahlreiche Reparaturen und Manipulationen zu einem beklagenswerten Zustand führten. Unter anderem arbeiteten Giovanni Fedrigotti (1718), Andrea Montesanti (1759) und Giuseppe Antonini (1804) an dem Instrument. Glücklicherweise führten die Zustände nie zu größeren Eingriffen, die die wertvolle Substanz des herausragenden Instrumentes nachhaltig zerstörten.

Eine sorgfältige Restaurierung und Rückführung auf den Originalzustand führte Giorgio Carli aus Pescantina in den Jahren 1995 bis 2006 durch. Die Antegnati-Orgel von Mantua gehört zu den wertvollsten und besterhaltenen Zeugnissen des frühen italienischen Orgelbaus.

Das Instrument steht auf der rechten Seitenempore vor dem Chor und der dreigliedrige Prospekt ist mit zwei reich bemalten Flügeltüren zu verschließen. Hinter der Orgel befindet sich ein geräumiges Balgzimmer mit vier Keilbälgen, die entweder manuell oder computergesteuert betätigt werden können. Frontal ist die Spielanlage eingebaut, bei der sich die Registerhebel zum Einhaken auf der rechten Seite befinden.

Die Stimmung ist mitteltönig und liegt bei a¹ = 462 Hz.